Les organites tubulaires :
Ceux ne sont pas des organites membranaires mais de petites tubes :
- soit libre ou isolé, sous forme de cylindre de 250 nm de long.
- soit associé à des figures plus complexes comme les centrosomes, les corpuscules basaux, les cils, et les flagelles.
Chez les eucaryotes, on distingue deux types de microtubules en fonction de la technique de fixation.
- les microtubules sont labiles (instables) et disparaissent lorsque le tissu est traité à basse température 4 degrés. Il faut les fixer par le tetroxyde d'osmium et la glutaraldéhyde. On les trouve dans les prolongements cellulaires de cellules libres (amibe), dans les axones de neurones et dans les fuseaux de division.
- d'autres sont stables à 4 degrés et on les trouve en figures complexes dans les centrioles, les cils et les flagelles.
1/ structure du centriole :
Au microscope optique, on trouve des petits points par paire. Au microscope électronique, on voit deux associations de 2 centrioles représentant de cylindres creux formés de microtubules.
Les
embryons en développement. [Pierre Gönczy/EPFL]
source: http://scienceline.ucsb.edu/images/centriole2.png
Différence entre cil et flagelle :
- les cils sont nombreux, courts et mesurent moins d'un µm. Il comporte un corpuscule basal et font en général déplacer un liquide autour d’eux.
- la flagelle est plus longue, elle mesure entre 20 et 30 µm en général et est unique. Elle assure le déplacement de la cellule.
2/Isolement et composition chimique :
Pour cette étude on utilise un protozoaire cilié le Tetrahymena*
Source: https://www.embl.org/news/lab-matters/the-hairy-single-celled-tetrahymena-provides-a-work-reset/
Tetrahymena* est une cellule eucaryote de ciliée +++ . Cette espèce est très commune dans l'eau douce. Sa dimension est de l’ordre de 50 µm.
Elle est inoffensives chez l’homme mais peut être pathogène chez les poissons en particulier les guppys.
Protocole :
il faut couper les cils à leur base par un battement unique énergétique.
- traitement par une solution alcoolisée d'éthanol à 90 % qui est peu toxique et rend la membrane perméable.
- traitement par L’E.D.T.A qui est chélateur des ions divalents. En l'absence de Ca ++ , les cils deviennent immobiles car le mouvement ciliaire est calcium dépendant.
-Puis on ajoute une forte concentration de Ca ++ sous forme de CaCl2 à 25mmol. On observe alors des mouvements brutaux des cils ce qui les cassent à leur base.
-On effectue une centrifugation à 1000 g pour séparer les cils et les cellules.
- le surnageant récupéré est centrifugé à 1000 g pour concentrer les cils. On obtient ainsi un culot de cils entouré par leur membrane plasmique.
Pour isoler les tubules on utilise le protocole suivant :
- il faut dissoudre la membrane par l'action ménagé d'un détergent. Il dissout les lipides membranaires et sépare les cils de la membrane.
- on effectue une centrifugation qui permet d'obtenir :
Dissection chimique permettant d'obtenir les différents types de microtubules :
Sur le culot de cils dénudé, on pratique une dialyse contre l’EDTA à pH8.
acide éthylènediaminetétraacétique, est un acide diaminotétracarboxylique de formule C10H16N2O8. pour son rôle de chélateur.
-Après plusieurs heures de dialyse on observe des doublets périphériques intactes et associés. On constate qu'il y a solubilisation des fibres rayonnantes, du doublet central, des bras séparés de microtubules A: ceci dans le sac de dialyse.
- par centrifugation et sous fractionnement, on sait parler doubler périphériques des bras et des sous-unités solubles.
1/ à partir du culot :
- en solubilise les doublets périphériques dans une solution de force ionique élevée : KCl à 0,6 M qui permet la rupture des liaisons.
- le résultat de la solubilisation est déposé sur un gradient préformé (analytiques). On isole ainsi une bande protéique majoritaire à 6 s, très homogène de poids moléculaire égal à 110000.
-Après traitement par l'urée (qui rompt les liaisons hydrogènes) et centrifugation sur gradient préformé de saccharose, on obtient deux bandes. Elles comprennent deux sous unités 3s liées par des liaisons hydrogènes de poids moléculaires 55000. Ce sont des protéines de forme globulaire appelées tubuline alpha et bêta.
2/à partir du surnageant:
- par centrifugation sur gradient préformé, on sépare des protéines : une fraction très dense de 30s correspondant au bras. Le traitement par l'urée ne montre pas de sous unité inférieure, il s'agit de la dynéine. Une fraction plus légère de dimère de 6s de tubuline alpha et bêta issu de la solubilisation des microtubules centraux sont mises en évidence.
3/Organisation moléculaire des microtubules :
expérience de réassociation in vitro :
A partir de dimères 6s de tubuline alpha, bêta et d’ions divalents de Ca2+ , on observe leur association en filaments fins et longs. Ce sont des proto filaments c'est-à-dire un auto assemblage de dimères.
L'association de 13 proto-filaments, en présence de Mg2+ , forme un microtubule en structure hélicoïdale décalée.
Il est possible de passer à une structure supérieure, car les microtubules s'assemblent entre eux, pour former des doublets par mise en commun de trois proto-filaments.
La reconstitution d'un cil complet est possible lorsque l'on met en présence :
- les doublets
- la fraction soluble des bras
- des ions Mg2+
La fixation des bras permet de reconnaître le microtubule A
4/Études des mouvements ciliaires:
A/ d'un point de vue moléculaire :
La dynéine formant les bras dès doublets de microtubules est une protéine ayant deux fonctions :
- protéines de structure.
- protéine enzymatique avec une fonction ATPase calcium dépendante.
Les bras, avec les doublets, forment un complexe protéique de tubulodynéine.
A l'endroit où les bras sont fixés, la dynéine hydrolyse l'ATP en produisant un décalage des sous unités entre elles. Les trois proto-filament commun représente un engrenage qui, quand à ce raccourci, il y a courbure d'un côté, puis quand B se raccourci, il y a courbure de l'autre côté. Ce phénomène est possible du fait de l'asymétrie des éléments accolés. Le couplage entre l'hydrolyse de l’ATP et l'action tubuline/dynéine entraîne la courbure de A et le mouvement se répercute sur B, tandis que à s'allonge. Cet ensemble forme un mouvement observable.
Ci-dessus: Un cil (c) en microscopie électronique en transmission
avec le corps basal (bb).
La plupart des corps basaux, ainsi que d’autres structures proches : les
centrioles, sont composées de 9 triplets de fibres de tubuline et ceci est vrai
pour les unicellulaires avec noyau comme pour l’être humain. Le cil lui-même est
composé de 9 doublets qui s’étendent à partir des triplets. De plus, il y a 2
fibres au centre de l’axonème (ax). Par R. Allen grossi 16,000X. Barre = 0.5µm.
Publié dans J. Protozool en 1967.
5/Études des mouvements:
A/ Point de vue moléculaire :
La Dynéine, formant les bras dédoublés de microtubule, est une protéine ayant deux fonctions :
- protéine de structure
- protéines enzymatiques ATpase calcium dépendante.
Les tubulines formant les microtubules n'ont pas d'activité enzymatique.
les bras avec les doublets, forme un complexe protéique.
La tubulodynéine à l'endroit où les bras sont fixés, hydrolyse l'ATP en produisant un décalage des sous unités entre elles. Les trois protofilament commun représentent un engrenage. Quand A ce raccourci, il y a courbure d'un côté, puis, quand B se raccourci, il y a courbure de l'autre côté. Ce phénomène est possible du fait de la symétrie des éléments accolés. Le couplage entre l'hydrolyse de l'ATP et l'action tubuline-dyneine entraînent la courbure de A et le mouvement se répercute sur B, tandis que A s'allonge.
L'ensemble forme alors un mouvement observable.
B/Observations des mouvements:
a/observation du mouvement d'un cils. il s'agit d'un mouvement pendulaire, dans un plan avec un aller actif et un retour passif. buffet le sa longueur et de sa rigidité, le cil ne peut pas présenter d'ondulation, résultats :
- déplacement de la cellule, exemple les procaryotes.
- déplacement d'un milieu liquide autour de la cellule, exemple l'épithélium cilié de la trachée.
b/Observation des mouvements d'un flagelle. il s'agit d'un mouvement ondulatoire. le mouvement du flagelle est créé à sa base et se propage naturellement à son extrémité, ou l'amplitude de l'ondulation temps à augmenter, résultats :
- propulsion (comme une godille)
6/ Mode d'action des antimitotiques :
ils sont ainsi nommés car ils provoque l'arrêt de la mitose. il en existe deux grands types ayant des actions sur les microtubules labile.
A/ les agents physiques :
le froid entre 0 et 4 degrés entraîne l'arrêt des divisions par dépolymérisation des microtubules, en déstabilisant les interactions hydrophobe entre les tubules alpha et les tubules bêta.
B/ les agents chimiques :
Les alcaloïdes comme la colchicine, la vintablastine et la podophylline provoquent le désassemblage des sous unités 6S. Les microtubules sont des dérivés centriolaires que l'on trouve dans le fuseau mitotique. Il s'agit d'un système labile. Ce que l'on observe n'est que le résultat de deux phénomènes simultanés, il y a une phase de formation et une phase de résorption.
La colchicine et la vintablastine se fixent sur la dimère 6S et empêchent la polymérisation en protomère. La formation est donc bloquée, on observe donc la phase de résorption. Les microtubules contrôlent normalement la migration des chromosomes lors de l'anaphase, ceci explique pourquoi les alcaloïdes bloquent les cellules en fin de métaphase. Ce phénomène est exploité lors de l'établissement d'un caryotype. La mitose est bloquée au moment où les chromosomes sont condensés.
Il va dire sans que tous ces produits ont des actions pharmacologiques antimorales mais ils sont assez toxiques.
Ils sont appelés également poison du fuseau.
1/ Technique d'analyse de la cellule
5/ Appareil de Golgi ou Dictyosome
13/ Complément sur la méthodologie de recherche en biologie cellulaire
